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PDS-1000台式基因槍操作流程
發表日期:2012-06-29

一.PDS-1000台式基因枪操作快速指南(在使用基因枪操作前,建议首先不使用微载体和靶细胞进行一次“dry run”,测试基因枪的气体通路一切正常后再进行实验)

轟擊前的准備工作

1.實驗前清洗與滅菌(高壓蒸汽滅菌)處理:破裂盤固定帽、微載體組件、載體膜及載體膜支架、終止屏

2.采用70%乙醇對PDS-1000台式基因槍腔體進行滅菌處理並晾幹。

注意:不要對腔體進行高壓蒸氣或加熱等滅菌處理,這樣會毀壞PDS-1000台式基因槍

3.洗滌微載體並儲存于50%的甘油,具體洗滌步驟如下(按下面步驟得到的微載體可進行120次轟擊實驗,每次轟擊使用約500ug的微載體)

a)  称取30mg微载体,将其放入1.5ml的离心管内

b)  在离心管内加入1ml 70%乙醇

c)  在涡旋混合器上充分震荡3~5分钟

d)  震荡结束后静置15分钟

e)  将上述含有微载体的70%乙醇溶液离心约5秒钟,弃上清

f)   在得到的微載體沈澱中加入1ml蒸餾水

g) 充分震荡1分钟

h) 震荡结束后静置1分钟

i)   将上述含有微载体的水溶液大致离心后弃上清,再重复f~i的步骤2次

j)   在得到的微载体沉淀中加入500ul经灭菌的50%甘油(如忽略上述洗涤步骤中的损耗,微载体的浓度为60mg/ml)

        注意:a)上述制备得到的微载体甘油溶液在室温下可保存2周;b)如为钨粉载体,建议在-20°C条件下储存避免氧化,而金粉载体可在4°C或室温下储存

4.在實驗的當天用外源DNA分子包埋微載體,具體包埋步驟如下(按下面步驟得到的微載體可進行6次轟擊實驗,每次轟擊使用約500ug的微載體)

a)從上述微載體儲存溶液中吸取50ul(3mg)的微載體加入1.5ml的離心管內

注意:從微載體儲存溶液中吸取微載體時,需將微載體儲存管放置在渦旋混合器上持續地、充分的震蕩,因爲這樣才能避免微載體之間形成聚合體從而使DNA均勻地包埋在微載體的表面

b)加入5ul DNA(1ug/ul)

c)加入50ul 2.5M CaCl2

d)加入20ul 0.1M 亚精胺,持续震荡2~3分钟

e)震蕩結束後靜置1分鍾後離心約2秒鍾,棄上清

f)在得到的沉淀中加入140ul 70%乙醇(HPLC级或分光光度计级),离心弃上清

g)在得到的沉淀中加入140ul 100%乙醇,离心弃上清

h)在得到的沉淀中加入48ul 100%乙醇,轻轻地拍打离心管管壁数次后,在低速的混合器上充分震荡2~3秒钟

5.将包埋得到的微载体放置于载体膜(Macrocarrier)及载体膜支架(Macrocarrier Holder)。首先准备一个带盖的经灭菌处理的60mm组织培养皿,在其底部铺上一层CaCl2作爲幹燥劑,並在CaCl2上放一張濾紙;然後將載體膜及載體膜支架放在濾紙上,不鏽鋼的載體膜支架與濾紙接觸而載體膜向上;最後用微量移液器吸取6ul(約500ug的微載體)經包埋處理的微載體水平地塗在載體膜中央直徑約1cm的範圍內,完成鋪塗後立刻蓋上組織培養皿的蓋子約10分鍾,使乙醇揮發。(具體操作如下圖所示)

注意:a)爲確保實驗結果建議使用最新包埋好的微載體;b)上述操作需在一個平穩的工作台上進行以避免震動引起微載體互相凝結;c)在吸取微載體時還需將經包埋處理的微載體儲存液放置在渦旋震蕩器上;d)上述操作制備得到的載體膜及載體膜支架在2小時後即不能使用,需重新制備。

6.将破裂盘放置到位。首先用经过灭菌处理的镊子取出破裂盘并在70%异丙醇液体内轻蘸几下进行灭菌;然后将上述处于湿润状态的破裂盘放置在破裂盘固定帽内;最后将上述含有破裂盘的破裂盘固定帽连接到基因枪腔体内的氦气气体加速管(gas acceleration tube)上,并用扳手拧紧。(具体操作如下图所示)

注意:a)取破裂盤必須使用經過滅菌處理的鑷子,因爲油脂、指紋以及手套上的粉末都會造成破裂盤與破裂盤固定帽之間不能緊密結合從而導致漏氣;b)在對破裂盤進行滅菌處理時不要將破裂盤長時間的浸在70%異丙醇內,否則會造成破裂盤的脫層;c)當破裂盤固定帽內沒有放入破裂盤時不要與氦氣氣體加速管擰緊,避免二者的金屬表面由于刮擦而引起漏氣;d)不能對破裂盤進行高壓蒸汽滅菌

 

 

7.根據具體的實驗條件調節破裂盤和載體膜之間的位置,最後放置終止屏

注意:在進行轟擊前確認在微載體組件內放置了終止屏,否則靶細胞會由于高速的微載體和載體膜而受到損傷

8.检查氦气瓶的压力,氦气瓶的压力需要超过具体破裂盘对应压力200 psi(如使用900 psi规格的破裂盘,那么氦气瓶的指示压力必须为1100 psi)

9.將待轉染的靶細胞或組織放在台式基因槍腔體內特定的位置上,關門

轟擊的流程

1.确认PDS-1000台式基因枪电源线连接完好,按下红色的“Power Switch ON/OFF”键开机

2.按下“Vac/Vent/Hold Switch”键设置在VAC档位对台式基因枪腔体抽真空,并维持在特定的真空度水平上(真空度至少为5英寸高的水银汞柱),达到最低的真空度时最右面的“Fire Switch”键的指示灯会闪烁。当达到设定的真空度时,迅速地将“Vac/Vent/Hold Switch”键设置在HOLD档位维持该真空度

3.按住“Fire Switch”键直到破裂盘破裂、氦气压力表显示为零才释放“Fire”键(具体操作如下图所示)

注意:a)在破裂盘破裂前释放“Fire Switch”键实验失败;b)在破裂盘破裂后长时间不释放“Fire Switch”键导致氦气的浪费;c)破裂盘破裂时会有轻微的响声,此时观察台式基因枪上方的氦气压力表就可以知道破裂盘破裂所需的具体压力;d)当压力达到设定值的90%左右时,破裂盘破裂所需的时间大致为11~13秒。

轟擊後儀器的維護

1.按下“Vac/Vent/Hold Switch”键设置在VENT档位停止对台式基因枪腔体抽真空;

2.當台式基因槍真空度顯示爲0時打開腔體門將實驗細胞或組織從腔體內取出;

3.将微载体组件(microcarry launch assembly)拿下,丢弃载体膜及终止屏;

4.取下破裂盘固定帽(rupture disks retaining cap)上使用后的破裂盘(rupture disks);

5.關閉氦氣瓶閥門。

 

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