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LP 层析系统简明使用教程
發表日期:2012-06-29
 

一、仪器名称:BioLogic LP层析系统

二、规格型号:BioLogic LP

三、生产厂家:Bio-Rad Laboratories, Inc

四、産品簡介

隨著生命科學研究進入後基因組時代,以蛋白質爲主要對象的研究成爲各實驗室研究的主題,其中,對單個蛋白質的分離純化是蛋白質研究的基礎工作,也是非常重要的工作。對純度均一蛋白質的研究是揭示生命規律的重要手段,也是新藥研發的必要途徑,因爲只有獲得一定量的蛋白質純品,才能滿足結構和功能的分析、物理化學參數測定、生物活性、毒理和藥理實驗等等,乃至大量制備用于診斷和治療。

蛋白質分離純化的重要問題是如何在純化過程中保持溫和的條件,從而保證在此過程中蛋白質的結構和活性不受影響。層析技術(Chromatography)爲蛋白質純化提供了這樣的條件,大都在室溫或低溫下操作,所用的流動相可以是與生理液相似的具有一定pH值、離子強度的緩沖水溶液,所用的填料表面修飾各種基團,可與蛋白質分子溫和接觸,從而保持了蛋白質分子的原有構象和生物活性。層析系統以及各種分離純化所需的填料和層析柱是保證該純化過程的穩定性、重現性和自動化進行所必需的設備。

五、技術原理

將一種混合物分成單個組份是一個熵減的過程,故外界必須要給此過程提供能量。如下圖所示,完整的層析系統主要包含泵、各種閥門、層析柱、各種在位檢測器和收集器。

其主要過程是:由蠕動泵推動溶液;各種閥門控制溶液流向,或者進樣,或者洗脫層析柱;樣品經過層析柱並洗脫後,以樣品各組分在流動相和固定相(層析介質)中的分配系數不同而保留不同,從而分開;不同組分經過各種在位檢測器,如紫外檢測器、電導檢測器、pH檢測器等確定各組分的位置和濃度;最後各組分由收集器自動收集。

其中,泵是層析系統的心髒,用以推動溶液流動,LP的泵是雙通道蠕動泵,可提供精確穩定,雙向變速可調的液流,可配不同直徑蠕動管,流速範圍爲0.01-40mL/min。檢測器是層析系統的眼睛,必須具有足夠的靈敏度。在層析中需要檢測的指標主要有離子強度,紫外/可見光吸收值,折光度,熒光值等。

層析系統爲層析技術及其過程提供了穩定、准確、可靠的自動化平台,而各種層析介質和層析柱則是層析技術的核心。各種層析技術簡介如下:

1、离子交换(ion exchange chromatography, IEC):利用蛋白质在一定缓冲液和pH条件下不同蛋白质具有彼此不同的电荷数目,从而与离子交换层析介质上的配基的相互作用不同,以不同离子强度或连续离子强度梯度的盐溶液将结合能力不同的蛋白质依次洗脱下来。蛋白质与离子交换介质之间的相互作用方式是多种多样的,不仅与蛋白质所带的净电荷有关,而且与蛋白质分子的空间结构和电荷分布等因素有关,每一种蛋白质具有其独特的性质,因此,在分离制备蛋白质时要选择不同的介质和不同的条件,主要有层析介质及其孔径和载量,如UNOsphere Q/S,MacroPrep High Q/S, DEAE和CM等,层析条件主要有缓冲液、pH值、离子强度等等。

2、凝胶过滤(Gel Filtration Chromatography,GFC):一种纯粹按蛋白质分子在溶液中的体积大小分离的层析方法,层析介质具有一定范围的孔尺寸,大分子进不去而先流出层析柱,小分子后流出。

3、羟基磷灰石層析(CHT):具有獨特的分離機理,是唯一直接用于蛋白質和核酸純化的無機層析填料,高度耐堿,生物安全性最高。其中PO43-離子與帶正電的蛋白質以離子鍵結合,具有離子交換特性,可由NaCl濃度梯度或磷酸鈉濃度梯度洗脫,其中的Ca2離子與帶負電蛋白質的自由羧基以金屬螯合方式結合,這種結合方式對NaCl不敏感,可由磷酸鈉濃度梯度洗脫。因此該填料既可以用磷酸鈉單梯度洗脫,也可以采用NaCl梯度洗脫後以低濃度磷酸鈉緩沖液平衡,再以磷酸鈉濃度梯度洗脫的雙梯度洗脫模型,以達到更高的分辨率。

4、亲和层析(Affinity Chromatography):利用生物大分子和层析介质表面存在的某种特异性吸附而进行选择性分离的层析技术。层析介质表面预先连接上配基,如Protein A、IDA、酶、抗原、激素等等,具有和配基有生物特性吸附的生物大分子与配基相互作用而被保留,没有这种相互作用的分子不能保留而先流出层析柱,再改变洗脱液的条件,如pH值、组成等,把吸附在层析柱上的蛋白质分子以纯品或较纯的形态洗脱下来。

5、疏水作用层析(hydrophobic interaction chromatography, HIC):蛋白质分子时一个外部有一亲水层包围、内部有疏水核并具有高级结构的复杂体系。尽管蛋白质表面亲水性很强,但也存在一些非极性的疏水基团或疏水区域,特别在高浓度盐溶液条件下,这些疏水基团向外伸展,可以和层析介质上的疏水配基相互作用,不同蛋白质的疏水特性不同,从而可以在不同盐溶液下实现不同的保留而被分离。通常疏水层析以高浓度盐溶液平衡上样,洗脱过程中盐浓度下降,蛋白质与层析介质上的配基的吸附力变为排斥力,从而蛋白质被洗脱。

六、結構組成


七、儀器操作

1、 将仪器电源打开,预热。

2、 缓冲液配制:根据所用层析方法和条件配置溶液,如果方法中要用到梯度洗脱,需配置A液和B液,分别将混合器的A、B管浸入到相应的溶液中,如图:

3、   冲洗管道系统:

在做實驗之前,必須采取合適的步驟以排除導管中的氣泡。

將A液及B液按右圖放置到位。 

A)確認未接層析柱。並將層析柱進口管與出口管對接。按下“Purge”按鍵,泵將以最大流速沖洗整個管道系統。

B)在泵運行時輪換按下“Buffer”鍵,讓所有緩沖液進口管道都充滿緩沖液然後將泵停下。

C)將流速調節到相對層析柱爲安全的流速,接入層析柱,按下“Run”鍵,將可能進入柱子的氣泡排除。

 

 

B)手動模式平衡層析柱:按模式鍵的Manual,再按組件設置鍵的Pump,則顯示屏顯示泵主界面如下:

 

按Flow下的功能鍵進入流速設置界面,如下圖:

用數字鍵輸入制定流速,按OK確定回到泵主界面,再按Start下的功能鍵開始以所設定的流速平衡層析柱,檢查電腦軟件中色譜圖的UV基線。

如果要以A、B兩種溶液以一定配比平衡或沖洗層析柱,則在上述泵主界面按Buffer下的功能鍵進入溶液混合界面:  

4個功能鍵,具有顯示屏當前所顯示的功能  

各組件指示燈,表示當前組件的狀態

模式切換鍵,用于切換手動、程序編輯、程序運行3中模式  

組件設置鍵,用于設置各組件,包括泵、收集器、警報、UV、電導、閥門和記錄儀等各參數

光標移動鍵,用于選擇顯示屏的光標位置所在的選項

色譜圖標記鍵,用于在色譜圖當前位置做標記  

數字鍵,輸入設定值

 

按Mix下的功能鍵進入

界面,光标移至Enter mixture后,输入B液的百分比,按OK下功能键确定并回到泵主界面,按Start下功能键开始冲洗或平衡层析柱。

5、方法編輯:一個完整的LP層析方法由3部分組成:泵步驟表、收集器表和警報器表,3個表各自編輯,保存後儀器自動將3個表按時間順序整合到一個完整的方法中。具體如下:

    A)泵步骤表编辑:

按Program模式鍵進入方法編輯界面;

选择New Method,进入方法步骤编辑界面并选择时间模式;

進入步驟編輯界面:

,按ADD下的功能键增加泵步骤,根据具体的层析方法编辑各个步骤,例如该仪器的Startkit,用标准样品走High Q强阴离子交换柱,用Previous/Next键选择Buffer A,按OK,输入步骤长度为3min,按OK确定,输入流速为1.5mL/min,按OK确定,这时已经编好了泵步骤的第一步,再按ADD依次继续编辑泵步骤表如下:

第二步:0%-50%B的梯度,10min,流速1.5mL/min;

第三步:Buffer B,6min,流速1.5mL/min;

第四步:Buffer A,6min,流速1.5mL/min;

第四步編輯完畢後按OK確定,回到方法主界面。

B)警報表編輯:

按Alarm下的功能鍵,按ADD,進入界面

,Alarm 1输入时间为3min,Hold设置为No。按2次OK确定。

設置該步後,方法運行後3分鍾警報器響,這提醒你必須將手動進樣閥切換到Load位,使梯度步驟的緩沖液直接流到層析柱中,而不是流到進樣環裏。

C)收集器表編輯:

在方法编辑主界面按Frac Coll下的功能键,进入

界面,選擇All,進入

,輸入收集體積爲2mL,按2次OK,確定並回到方法列表界面,選擇DONE,再按Save鍵,輸入方法名爲Demo1,按DONE確定。

6、方法運行

1)將MV-6手動進樣閥按逆時針方向轉動到底

2)用針筒吸取2mL標准蛋白樣品,插入到MV-6手動進樣閥頂部的進樣口,將樣品打入到進樣環中,並將針筒留在進樣口,不得拔出,否則樣品將從廢液管流出。

3)運行前檢查:

   A)检查手动状态下平衡柱子的情况,基线是否平衡,系统管道各处是否有气泡,如果有,必须对管道进行Purge;

   B)按组件设置键设置检测器:按UV,设置Range为0.05AUFS,ReZero基线调零;电导检测器的最大和最小值应满足B液和A液的电导值,可设置最小值为0,最大值为200mS/cm;

   C)按Program模式键,选择View Method检查所编辑的方法步骤是否与所设计的一致;

   D)检查组分收集器是否连接,并将收集器的第一管对准滴头下方。

4)運行方法:

A)按Run模式键,系统倒计时10秒后开始运行方法;同时点击软件工具栏的Log On按钮开始记录。

B)方法一開始,將手動進樣閥轉到最右邊,開始進樣,當警報響時,進樣結束,將手動進樣閥轉到最左邊。

7、運行後數據處理

   

八、注意事項

 

九、儀器部分組件校正

泵的校正:注意,校正泵流速前必須確保管道無任何氣泡,並將泵進水管浸沒到溶液或水中,用幹淨精確的小量筒接出水管道泵出的溶液或水。

按模式鍵的Manual,再按組件設置鍵的Pump,則顯示屏顯示泵主界面如下:

 

按Flow下的功能鍵進入流速設置界面,如下圖:

 

按Calibrate下的功能鍵,進入泵校准界面,

 

選擇泵蠕動管直徑,標准管可直接按各自直徑下的功能鍵,泵開始倒計時流動,倒計時結束時出現

界面,如果流速正常,按Nominal,如果有偏差,则按Set Flow进入

,輸入泵出的正確體積,按OK確認。

  

 

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