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Sequi-Gen? GT核酸电泳系统操作指南
發表日期:2012-06-28
 

一、准備工作:

1.    按照说明书彻底清洗全部组件,清洗过程中注意使用温和的水溶性的清洁剂或者说明书中允许使用的溶剂。每次使用完毕后必须立即清洗晾干,不能浸泡过长时间。

2.    根据IPC规格准备合适体积的电泳缓冲液。

二、安裝玻璃板:

    安装玻璃板时需要戴一次性手套,以避免指纹或杂质留在玻璃板上造成灌胶时混入气泡。

3.    用硅化试剂或者其他包被剂处理玻璃板以确保在卸板时凝胶在两块玻璃板之间不发生粘连(推荐处理长玻璃板,如用于银染则处理IPC板)。

4.    如图1依次放置IPC板(玻璃板面朝上)、隔条和长玻璃板(处理面朝下)。 隔条长边要与IPC板的玻璃板边缘对齐,短边要与IPC板和长玻璃板的下缘平齐。

5.    在用夹具将其夹起来之前,用双手把三者堆叠成的Sandwich竖起来,长玻璃板的一面朝外,IPC板一面面向操作者。

6.    如图2垂直拿起夹具,将有扳杆的一侧面向操作者,夹住Sandwich。上下滑动使之与玻板和隔条的下缘对齐后用板杆固定。安装时板杆在IPC板一侧并垂直于IPC板,夹具滑动到合适的位置后向IPC板方向扳动即可固定。

7.    如图3 将IPC板一面朝上平放整个装置,检查两个夹具是否平行;玻璃板、梳子和夹具的下缘是否对齐。必要时需要松开板杆,对齐后再重新安装。

8.    插入梳子检查其能否合适地插入,再次确认整个装配过程无误。通常来说梳子插入过程中会有适当的阻力,但插入过程顺畅,不会引起梳子的损伤。


三、灌膠

Section 7.1 包含有一个用于DNA测序所需试剂的清单。聚丙烯酰胺是一种危险的化学和神经毒素,实验过程中要戴手套、穿工作服、使用安全的,不易破碎的玻璃器皿。

9.    按照Section 7.1 和Section 7.2准备凝胶溶液。凝胶溶液在大于等于26 in./Hg真空条件下抽气5-15分钟,确保凝胶制备的可重复性。

10.將灌膠底座開口朝上放置,裏面放入灰色的襯墊(不能有任何水分,必須擦淨晾幹後才能使用)。把夾好的Sandwich(豎直)放入灌膠底座時要把凸輪的銷子向外拉出。

11.確保整個裝置各個組件的下緣必須平齊並能夠與襯墊緊密結合。

12.如圖4,夾好的Sandwich放入灌膠底座後,凸輪插入夾具對應的孔中,慢慢地使用均衡的力量轉動兩邊的凸輪把基座與整個裝置固定起來。

13. 将整个装置连同底座平放在桌面上,IPC板一面朝上,仔细观察底座下面的注射孔,前期安装工作无误的话应该看到两层绿色的玻璃板之间会有等同于隔条厚度的一个缝隙。如果不能看到,重新安装使该缝隙位于灌胶孔的正中(如图5所示)。

14.用水平仪校准整个装置在水平状态下后进行灌胶,否则可能导致渗漏。38 x 50 cm的IPC板灌胶时顶端比末端高出4-5cm,灌胶后再恢复水平。

15.准備好注射器和連通裝置。

16.新鮮配置過硫酸铵,和TEMED一起加入抽氣的膠液中,混合均勻。緩緩地把膠液吸到注射器中。輕輕敲打管壁,使氣泡從前端排出。

17. 如图6所示连接注射器和灌胶底座。确保连接牢固,如图7所示缓慢地以恒定压力注射胶液到两块玻璃板之间。

18.  以下的数据是避免灌进气泡的灌胶速度的经验值,根据IPC规格的不同而不同。0.4 mm厚的隔条,50 cm长的胶的时间是40-45秒,0.25mm厚的隔条,50 cm长的胶的时间是50-65秒。由于污染或者硅化、包被不均匀,气泡容易在胶的上方出现。为避免出现气泡,每次都应彻底清洗玻璃板和处理外面的玻璃板。  

19.  胶液缓慢注入两块玻璃板之间,灌满并达到短板(有缺口玻璃板的)上端约1cm处,如图8放置注射器不再挪动。

20.  插入梳子至预期深度,用铁夹子夹好。

21. 让胶凝30-60分钟。确认胶凝以后,再把注射器等取下,用热水清洗注射器,去除全部凝了的聚丙烯酰胺胶,再用蒸馏水清洗。

22.  去掉下端的灌胶槽,及时清洗凝胶。

四、操作准備

23.在外板的中心附近安裝溫度檢測裝置。

24.如圖9把整個裝置放在電泳的下槽,安裝好固定棒。

25.向上槽中注入配好的1xTBE,避免緩沖液濺出,確保整個裝置不會在電泳過程中傾翻。

26.  保证注入足够整个电泳过程使用的缓冲液。拔出梳子,用注射器或者加样枪彻底冲洗胶面,如果使用鳄鱼齿梳子则需要清洗胶面和梳子后,在上样前倒过来再次插入,直到鳄鱼齿刚好到达胶面。

27.往下槽中加入350-500mL緩沖液,一定不要超出500mL,否則會在電泳過程中造成擊穿。

28.蓋上安全蓋進行預電泳,直到達到預期的溫度。預電泳可以部分消除微笑效應,另外,提前加熱緩沖液到50度可以減少凝膠溫度到達預期溫度的時間。

29.電泳過程中會由于蒸發的原因造成上槽緩沖液液面下降,所以需要注意觀察,如果需要的話就及時添加,避免電泳過程中上槽緩沖液液面下降到短板的凹槽後可能造成的電弧擊穿。無論任何時候都不能讓凝膠的溫度超過60度。

五、上樣

30.關掉電源,拿掉安全蓋。用注射器或者加樣槍清洗膠面。

31.用微量注射器或者加樣槍上樣。

六、電泳

32.連接各個組件,參照說明書的表4.3設定需要的參數,開啓電源。注意觀察電極處是否有氣泡出現,確認電源接通。

33.觀察指示劑的位置以確定電泳的時間。

Polyacrylamide Bromophenol Gel

Percentage Blue

Xylene Cyanol

5%

35 bases

130 bases

6%

26 bases

106 bases

8%

19 bases

75 bases

10%

12 bases

55 bases

七、卸板

34.關掉電源,如圖10抽出部分上槽緩沖液。

35.取出Sandwich,在吸水紙上放一下後倒掉剩余的緩沖液。

36.倒掉下槽緩沖液,注意不要用IPC板儲存緩沖液,應及時清洗並妥善保存。

37.去掉夾具,長玻璃板朝上放置Sandwich。

38.緩慢分開兩塊玻璃板。

39.往凝膠上覆蓋一層濾紙(伯樂産品序列號165-0921),用力壓濾紙確保與膠粘附。

40.  用剪刀或者剃刀修去周围多余部分,揭下凝胶。

41.  滤纸面朝下放置凝胶,覆盖一层塑料膜。修剪周围多余部分。

42.凝膠拿去用于幹膠或放射自顯影等下一步實驗。

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